作业帮NC转印膜在生物实验中的具体应用怎样
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/04 04:24:38
NC转印膜在生物实验中的具体应用怎样
NC转印膜在生物实验中的具体应用怎样
NC转印膜在生物实验中的具体应用怎样
在Northern Blot、Southern Blot、Western Blot中都需要用到NC膜,
杂交技术有固相杂交和液相杂交之分.固相杂交技术目前较为常用,先将待测核酸结合到一定的固相支持物上,再与液相中的标记探针进行杂交.固相支持物常用硝酸纤维素膜. 固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交.前者包括三个基本过程：第一,通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二,用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三,杂交信号的检测. 用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交.某特点是靶分子固定在细胞中,细胞固定在载玻片上,以固定的细胞代替纯化的核酸,然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里,探针进入组织细胞与靶分子杂交,而靶分子仍固定在细胞内.例如.可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交,以确定有无该病原体的感染等.原位杂交不需从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性,在临床应用上有独特的意义.下面以放射性标记探针与固定在NC膜上的核酸进行杂交为例,杂交反应操作如下： ① 配制所需试剂 SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl,0.3mol/L柠檬酸钠. Denhardt’s溶液(50×)：聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml. 预杂交液：6×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,100?g/ml经变性或断裂成片段的鲑精DNA. ② 将含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面,使其由下至上完全湿润,并继续浸泡2分钟. ③ 将湿润NC膜装入塑料袋中,按0.2ml/cm2的量加入预杂交液,尽可能挤出气泡,将袋封口,置68℃水浴1-2小时或过夜. ④ 将双链探针做变性处理使成单链,即于100℃加热5分钟,然后立即置冰浴使骤冷. ⑤ 从水浴中取出杂交袋,剪去一角,将单链探针加入,尽可能将袋内空气挤出去,重新封口,并将杂交袋装入另一个干净的袋内,封闭,以防放射性污染. ⑥ 将杂交袋浸入68℃水浴,温育8-16小时. ⑦ 取出杂交袋,剪开,取出滤膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS中,室温振荡5分钟,勿使滤膜干燥. ⑧ 将NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中,室温漂洗15分钟. ⑨ 将NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中,37℃漂洗30分钟至1小时. ⑩ 将NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中,68℃漂洗30分钟至1小时. ⑾ 取出滤膜,用0.1×SSC室温稍稍漂洗,然后置滤纸上吸去大部分液体,待做杂交信号的检测.
western blot 转膜的时候用
额